Клиническое секвенирование экзома: что это такое в генетике

Что это такое

При секвенировании экзома исследуются только наиболее важные области, кодирующие белок, благодаря чему можно обнаружить 85% аномалий. Кроме того, эти участки (экзоны) составляют около 1,5% всего генома. Если бы не цена в 300 тысяч рублей за секвенирование генома, не было бы смысла создавать более дешевую альтернативу — секвенирование экзома.

На днях мы наконец получили результаты анализа от Genomed, которого ждали почти 3 месяца. Стоимость анализа 50 тысяч рублей, и это хорошо, что мы сделали это тогда, неизвестно, сколько он сейчас стоит (хотя, возможно, пока не подорожал), потому что лаборатории, куда отправляют кровь, нет Россия, но в Индии.

Секвенирование экзома

В 2014 году секвенирование экзома стало стоить в 2 раза дешевле (до 100 тыс. Руб.) За счет сотрудничества с новой лабораторией (раньше в Индию не отправляли, а куда-то еще дороже), а не брать было стыдно шанс узнать как можно больше понять любые прогнозы.

Конечно, было бы неплохо провести этот анализ пару лет назад, но, к сожалению, нам приходится назначать некоторые тесты самим, потому что предыдущие визиты к генетикам закончились — «мы не видим в вас ничего генетического, идите дом.» Несмотря на это, мы все же решили довериться своей интуиции и продолжать копать дальше. Я чувствую, что если мы когда-нибудь что-нибудь откопаем, то репутации генетиков будет мало. Это как-то глупо…

Заключение MGC после 4-х консультаций

Что включает клиническое секвенирование экзома?

Секвенирование. Диагностическое секвенирование экзома (DES) включает в себя секвенирование примерно 20 000 генов. Это отличает его от полногеномного секвенирования, так как метод направлен на изучение 1-2% участков генома, кодирующих синтез белка, которые, как считается, являются ответственными за присутствие примерно 85% от числа известных заболеваний. Цель DES — выявить изменения, определяющие фенотип пациента.

Анализ и проверка: после завершения секвенирования все полученные данные проходят через конвейер биоинформации и впоследствии анализируются медицинской бригадой. Для каждого обнаруженного изменения проверяется, связано ли оно с изучаемыми фенотипическими характеристиками. Потенциально связанные изменения передаются на анализ совместной сегрегации.

Формирование отчета: каждый случай проходит различные уровни медицинского обследования, и только после последнего создается отчет. Каждый отчет предназначен для конкретного пробанда (человека, чья генетика исследуется), а также включает в себя обзор и анализ литературных данных. Подготовка отчета может занять от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от сложности исследования.

Описание

Полное секвенирование экзома: включает анализ кодирующих последовательностей всех известных генов. Геном — это совокупность всего наследственного материала, содержащегося в клетке организма. Экзон — это последовательность ДНК, которая кодирует синтезированный белок. Экзом — это совокупность всех экзонов. Он составляет менее 2% всего генома. Клинический экзом — это совокупность всех генов экзома, клиническая связь которых с заболеванием доказана научно. Он составляет около четверти генов в полном экзоме. Клиническое секвенирование экзома — оптимальное исследование при подозрении на наследственные заболевания с точки зрения взаимосвязи между вероятностью обнаружения клинически значимых мутаций и затратами на исследования. Он содержит 85% всех известных клинически значимых мутаций. Секвенирование — установление нуклеотидной последовательности ДНК, самый точный анализ наследственной информации на сегодняшний день. Генетическая структура ДНК определяет наличие генетических (наследственных) заболеваний. Доступно более 4800 генов. Преимущества методов секвенирования Секвенирование выполняется один раз в жизни. Обзор не требуется. Во время секвенирования пациент и врач получают всю необходимую информацию о структуре генов, что исключает необходимость дальнейшего генетического тестирования и неопределенности в диагнозе. Преимущество исследования «секвенирование экзома» перед анализом всего генома состоит в том, что оно позволяет проводить массовый одноразовый скрининг наиболее важных, например, кодирующих белок последовательностей.

Особенности проведения исследования

Сочетание симптомов у некоторых пациентов не позволяет врачу поставить точный диагноз

В таких случаях часто выбирается пошаговая стратегия диагностики, что делает тестирование трудным, трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, отсроченный диагноз может существенно повлиять на состояние и качество жизни пациента.

Узнайте больше о рутинном молекулярном тестировании пациентов

Обычное молекулярное тестирование пациентов с генетическими заболеваниями часто основывается на исследовании одного гена или группы (набора) генов. Однако, по оценкам, до 50% пациентов остаются недиагностированными, и после таких тестов диагностика болезни может занять несколько лет и никогда не привести к положительному результату 1 .

При полном секвенировании экзома чаще обнаруживается несколько вариантов, которые редко (или даже не встречаются) у других пациентов. Эти варианты являются вариантами неустановленной клинической значимости (VUS или VOUS). Для них можно только представить, насколько они «вредны», и относиться к ним с особой осторожностью. Большинство этих редких вариантов не приводят к развитию каких-либо заболеваний.

Чтобы понять, может ли эта вариация быть причиной заболевания, чрезвычайно важно получить конкретную и подробную клиническую информацию от пробанда и родственников при выполнении секвенирования экзома.

Когда рекомендуется проводить анализ клинического экзома?

• Причина клинического состояния пациента неясна.
• Предыдущие тесты не выявили генетической причины заболевания.
• Причиной клинического состояния пациента могут быть несколько равновероятных наследственных заболеваний.
• Анализ одного гена дороже полного исследования и менее информативен.
• Предполагается, что это редкое наследственное заболевание, для которого недоступны специальные генетические тесты.

Многие генетические заболевания схожи по клиническим симптомам, хотя могут быть вызваны мутациями в совершенно разных генах. С другой стороны, другие заболевания вызываются мутациями в одном и том же гене, но имеют разные симптомы. Некоторые заболевания могут быть связаны как с мутациями генов, так и с неблагоприятной окружающей средой. Все это сильно затрудняет постановку точного диагноза. В то же время большинство генетических тестов предлагают исследовать ограниченное количество генов и только в определенных областях. Это приводит к тому, что направление на анализ не дает результата, а диагноз остается неясным.

Преимущество клинического секвенирования экзома заключается в одновременном изучении 4700 генов по всей их длине. Это позволяет заменять дорогостоящие анализы каждого гена отдельно. Клиническое секвенирование экзома значительно увеличивает шансы выявления генетического заболевания в семье, что позволяет более точно определить прогноз для пациента и его родственников, а также правильно подобрать терапию.

В некоторых случаях для определения патогенности выявленных мутаций может потребоваться обследование родственников пациента

Показания для проведения исследования

• В качестве теста первой линии для диагностики генетически гетерогенных заболеваний (когда предполагается, что несколько генов вовлечены в конкретное заболевание) и для уточнения прогноза течения болезни, например:

1. эпилепсия,
2. расстройства аутистического спектра,
3. нервно-психические расстройства,
4. заболевания соединительной ткани,
5. нарушение обмена веществ,
6. кардиомиопатия,
7. сложные дисморфизмы,
8. иммунологические нарушения,
9. слепота.

• С задержкой развития недифференцированного генеза.
• Дети с множественными врожденными аномалиями, нервно-психическими расстройствами и судорогами.
• Для плода с аномалиями, обнаруженными при ультразвуковом исследовании, когда молекулярный анализ (CMA) и цитогенетический тест не позволили установить окончательный диагноз.
• При проведении комплексной диагностики в послеродовом периоде.

Интерпретация результатов секвенирования экзома требует консультации с генетиком независимо от результата теста.

Как именно работает экзомное секвенирование?

Секвенирование экзома — это широко используемый метод секвенирования следующего поколения (NGS), который считывает определенные части каждого гена, которые считаются наиболее важными для распознавания болезни. Эти части называются экзонами.

Эти «чтения» содержат большой объем информации о генетической последовательности, анализ которой вручную займет сотни часов.

Затем большой список идентифицированных вариантов «интерпретируется» путем сравнения результатов с базами данных, в которых перечислены известные или предполагаемые варианты, связанные с генетическими заболеваниями. Интерпретация, а также секвенирование — сложный и трудоемкий этап секвенирования экзома, так как для определения значения каждого найденного варианта требуется работа многих экспертов.

Лабораторный процесс

Методология

Секвенирование экзома включает четыре этапа: выделение ДНК из предоставленного материала, выбор интересующей фракции ДНК (обогащение образца), секвенирование выбранного материала и анализ результатов.

Выделение ДНК

Первым шагом является приготовление высококачественных препаратов геномной ДНК из полученных образцов путем отделения ДНК от белков, липидов и т.д. Стандартный метод выделения ДНК — экстракция смесью фенола и хлороформа

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко используется для амплификации желаемых фрагментов ДНК более 20 лет. Обычно в ПЦР используются только 2 праймера, однако были разработаны методы мультиплексной ПЦР, которые используют несколько праймеров и позволяют одновременную амплификацию нескольких ДНК-мишеней за один прогон. Подходы с использованием ПЦР очень эффективны, но не позволяют работать с участками генома длиной несколько миллионов п.н из-за высокой цены и низкого качества получаемых образцов.

Метод молекулярной инверсии

Метод молекулярной инверсии

Молекулярная инверсия — это метод, позволяющий получить обогащенные образцы ДНК в амплифицированных инвертированных частях целевых последовательностей. Выбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания интересующей области в кольцо. Праймер здесь представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид ДНК, в центральной части которого находится универсальная последовательность с сайтами рестрикции, а концы комплементарны двум областям геномной ДНК, между которыми расположена интересующая последовательность. Непрореагировавшие образцы остаются линейными и удаляются экзонуклеазами. Метод может быть полезен при работе с небольшим количеством мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток — однородность получаемых образцов, а также высокая стоимость при необходимости покрытия большого набора площадей.

Гибридизационное обогащение

Для обогащения путем гибридизации образцов с участками экзома создаются специальные микрочипы, содержащие одноцепочечные олигонуклеотиды (зонды), закрепленные на субстрате с геномными последовательностями, способными покрывать интересующие области. Геномная ДНК разрезается на фрагменты. Концы фрагментов сглаживаются рестрикционными ферментами, добавляются адаптеры с универсальными праймерами. После гибридизации фрагментов с зондами микрочипов негибридизированные фрагменты смываются с субстрата, а оставшиеся фрагменты затем амплифицируются с помощью ПЦР. Ограничения метода связаны с высокой стоимостью оборудования, количеством зондов, которые можно разместить на матрице, и необходимостью в достаточно больших количествах ДНК для анализа.

Платформы, используемые для обогащения экзома

Основными поставщиками платформ для обогащения экзомов являются NimbleGen, Agilent и Illumin.

Сравнение характеристик каждой из наиболее распространенных платформ для обогащения экзомовБиблиотека SeqCap EZ Exome от NimbleGen Sure Select Human All Exon Kit от Agilent TruSeq Exome Enrichment Kit от Illumina Nextera Rapid Capture Exome Kit от Illumina

Длина зондов	55 — 105	114 — 126	95	95
Рекомендуемое количество образца ДНК	3 мг	3 мг	500 нг	50 нг
Тип зонда нуклеиновой кислоты	ДНК	РНК	ДНК	ДНК
Стратегия покрытия интересующего фрагмента зондами	Перекрывающиеся зонды	Зонды более строго последовательные, чем наложенные	Интервалы между последовательностями зондов (зонды находятся на некотором расстоянии друг от друга по последовательности фрагментов)	Промежутки между последовательностями зондов
Метод фрагментации	УЗИ	УЗИ	УЗИ	Транспонирование
Размер целевого фрагмента (человек)	64	50	62	62
Считывает это оставшееся после фильтрации	66 %	71,7 %	54,8 %	40,1%
Сильные стороны	Высокая чувствительность и специфичность. Более равномерное покрытие в сложных регионах .	Хорошее индель-покрытие. Высокая скорость выравнивания. Меньше перечитываний, чем на других платформах.	Хороший охват нетранслируемых участков и миРНК	Хороший охват нетранслируемых участков и миРНК
Основные недостатки	Больше перечитываний Agilent. Более низкая скорость выравнивания.	Показания более низкого качества, чем у NimbleGen	Высокий уровень несоответствующего обогащения	Высокий уровень несоответствующего обогащения. Смещение покрытия для областей с высоким составом ГХ, что снижает однородность.
Используйте не только для человеческих последовательностей	Ага	Ага	Нет	Нет

В настоящее время NimbleGen предлагает наборы для экзомов кукурузы, ячменя, пшеницы, сои, мышей и свиней, а также наборы, предназначенные только для людей, в то время как Agilent предлагает наборы для экзомов мышей, крупного рогатого скота и рыбок данио. Оба поставщика также предлагают возможность создавать индивидуальные наборы для других видов. В наборах для нечеловеческих видов используются протоколы и зонды, аналогичные наборам, поставляемым людьми. Оба производителя предлагают гибкий процесс проектирования, который позволяет вносить изменения для улучшения покрытия для определенных регионов и целей .

Что необходимо предоставить для клинического секвенирование экзома?

Чтобы выполнить секвенирование экзома, вам необходимо:

1. Заполненная справочная форма для тестирования (для каждого члена семьи, в том числе для тех, чьи данные отправлены на анализ совместной сегрегации).
2. Заполненная форма согласия пациента на тестирование экзома (включена в анкету пробанда).
3. Образцы от пациента и, при необходимости, от членов семьи (все родственники пробанда первой степени, дальние родственники с тем же фенотипом, что и пробанд).
4. Семья и клиническая информация:
   • Подробный анамнез пациента (в виде подробных медицинских карт)
   • Копия семейной истории (генеалогическое древо)
   • Копии результатов предыдущих тестов

Подготовка

Генетическое тестирование не требует специальной подготовки. Кровь для исследования берут утром натощак. Кровь желательно сдавать не ранее, чем через 4 часа после последнего приема пищи. Перед постановкой диагноза не рекомендуется подвергать себя стрессовым ситуациям, употреблять спиртные напитки и курить. Диета и лекарства не влияют на выполнение теста.

Готовность

90 рабочих дней.

Применение экзомного секвенирования

Используя секвенирование экзома в исследованиях с фиксированной стоимостью, мы можем секвенировать последовательности со значительно большей глубиной охвата, чем покрытия, полученные при секвенировании всего генома. В связи с этим секвенирование экзома чаще всего используется для решения задач, требующих надежного определения однонуклеотидных полиморфизмов.

Клиническая диагностика

29 сентября 2011 года Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предложившей секвенирование экзома и диагностику заболеваний, связанных с экзомом. Компания утверждает, что результаты секвенирования экзома позволят сотрудникам диагностировать заболевания, для которых традиционные диагностические подходы неприменимы.

Выявление мутаций, вызывающих заболевание, может внести значительный вклад в диагностические и терапевтические подходы, помочь предсказать развитие болезни и сделать возможным тестирование родственников из группы риска. Существует несколько факторов, по которым секвенирование экзома предпочтительнее моногенного анализа: способность идентифицировать мутации в непроверенных генах из-за атипичных клинических проявлений и идентификация клинических случаев, в которых мутации в разных генах вызывают разные проявления у одного и того же пациента. Кроме того, метод позволяет диагностировать заболевания на ранних стадиях и у маленьких пациентов до появления полного спектра характерных симптомов; он также используется для пренатальной диагностики. В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома выявляет генетические заболевания, а стандартные методы (кариотип и использование микроматриц) неэффективны.

Авторы ведущей рецензируемой публикации по секвенированию экзома подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, которые использовали секвенирование экзома для выявления мутации, вызывающей синдром Барттера и врожденную хлоридную диарею, говорят: «Мы видим будущее, в котором такая информация станет частью ежедневной клинической оценки пациентов с подозрением на генетические заболевания с неясным диагнозом. Мы ожидаем это полное секвенирование экзома внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и как они участвуют в развитии редких и частых заболеваний человека, а также в клинической практике» .

Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах и менделевских болезнях править | править код

Текущие крупные международные исследования направлены на определение частых полиморфизмов в геноме, которые легче идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие чрезвычайно тяжелые заболевания, особенно менделевские болезни, встречаются со значительно более низкой аллельной частотой и могут оставаться незамеченными при поиске генов-кандидатов с использованием современных стандартных методов генотипирования, в то время как чаще всего они обнаруживаются в пределах границы и некоторые. Поскольку многие гены связаны с риском заболевания при сложных расстройствах, для их обнаружения требуются очень большие выборочные исследования, поэтому с точки зрения затрат секвенирование всего генома не является оптимальным. Кроме того, полиморфизмы в кодирующих областях изучены очень подробно, и их функциональное значение легче определить. Успешная модель для идентификации менделевских генов включает идентификацию полиморфизмов de novo при секвенировании генов от двух родителей и сыновей .

Использование в сельском хозяйстве

Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто полиплоидными; в результате некоторые из наиболее экономически важных сельскохозяйственных культур не могут быть изучены с помощью полногеномного секвенирования. На основе накопленных транскриптомных данных был разработан набор для обогащения экзома пшеницы, с помощью которого я использую исследование нежелательной внутрикультурной генетической гетерогенности экзома, которая влияет на фенотип растения, в частности, скорость роста, способности жить в разных условиях и других важных для разведения признаков. Подобные наборы использовались при исследовании риса Oryza sativa и сои Glycine max. Также возможно идентифицировать генетические маркеры, ответственные за особую устойчивость сельскохозяйственных культур к определенным патогенам .

В некоторых случаях секвенирование экзома может использоваться как альтернатива более дорогостоящему секвенированию всего генома, например, при изучении генетической изменчивости внутри и между популяциями.

Как выглядит результат секвенирования экзома

Какие данные входят в отчет?

Общие результаты: положительные, предположительно положительные, отрицательные, неоднозначные.

• Краткая информация о переделках.
• Сводная информация о генах.
• Сводная информация о болезни.
• Количество найденных переделок.
• Результаты анализа совместной сегрегации (если есть).

Первичная информация может быть ограничена информацией, непосредственно связанной с фенотипом. Это помогает выделить наиболее полезную информацию для диагностики заболевания. Дополнительная информация часто содержит более подробные данные, относящиеся к экзому в целом, независимо от отношения к фенотипу.

Дополнительная информация: зависит от предпочтений пациента и возраста. Этот отчет обсуждается отдельно. Дополнительная информация включает только известные патогенные или предположительно патогенные изменения. Клинически незначительных и доброкачественных изменений не сообщалось. Дополнительная информация передается только пробанду. Другие члены семьи не получают отчета с дополнительной информацией, однако можно предположить переносимость на основании выводов пробанда.

Результат секвенирования

Проблема в том, что не все мутации можно обнаружить с помощью секвенирования экзома. Также существует возможность ошибки. А обнаружение неисследованных мутаций (только в нашем случае) вообще ничего особенного не может сказать.

Вот отрывок из заключения, если вам интересно:

Ранее незарегистрированная гемизиготная миссенс-мутация была обнаружена в экзоне 2 гена PRPS1 (chrX: 106882652; C> T), что привело к замене аминокислоты триптофана на аргинин в кодоне 84 (p.R84W; ENST00000372435). Гомозиготные мутации в гене PRPS1 приводят к Х-сцепленным рецессивным синдромам, таким как: синдром Артса (OMIM # 301835), Х-связанный тип Шарко-Мари-Тута (OMIM # 311070) и гиперактивность фосфорибозилпирофосфатсинтазы I (OMIM # 300661) . Мутация p.R84W не зарегистрирована в базах данных 1000 геномов и в базах данных SIFT, LRT и Mutation Taster считается вероятной патогенной.

На основании вышеизложенного данная мутация оценивается как мутация с неизвестной клинической значимостью и требует сравнения с клиническими признаками.

выявлена ​​ранее не сообщавшаяся гетерозиготная миссенс-мутация в экзоне 8 гена PTEN (chr10: 89720750; G> G / A), приводящая к замене аспарагиновой аминокислоты на аспарагиновую кислоту в коде 301 (p.D301N; ENST00000371953) Гетерозиготные мутации в гене PTEN приводят к развитию аутосомно-доминантного синдрома Каудена 1 (OMIM # 158350). Мутация D301N не зарегистрирована в базах данных 1000 геномов и в базах данных SIFT, LRT и Mutation Taster считается вероятной патогенной.

На основании вышеизложенного данная мутация оценивается как мутация с неизвестной клинической значимостью и требует сравнения с клиническими признаками.

Скорее всего, вы ничего не поняли и я тоже не все понимаю, но я уже читаю, читаю. Жалко только, что на русском очень мало информации, а вот на английском такой уровень нужен, чтобы понимать то, чего у меня нет. Но ничего, есть Google Translate! А пока могу сказать, что синдромы, которые возникают в самих генах, так сказать, совсем нехорошие. И хотя большинство людей являются носителями всевозможных тяжелых синдромов, сохраняя при этом хорошее здоровье, в нашем случае с Егором клиническая картина все портит, это говорит только о том же синдроме Арта и моторной сенсорной нейропатии.

при этих синдромах смущает, что ребенок не подвергается сильным физическим нагрузкам. И это нам сейчас очень важно понять, чтобы не повредить реабилитацией в Китае (нужно знать, сколько мы можем его зарядить). Конечно, это не только сбивает с толку, но и мы подумаем о многих других неприятных симптомах позже, когда прояснится ситуация. Наверное, главный удар для нас состоит в том, что при этом синдроме у ребенка всегда есть умственная отсталость и, как выяснилось, мы совершенно к этому морально не готовы.