Кольцевая ДНК в митохондрии: исследование и характеристика

История открытия

Митохондриальная ДНК была открыта Маргит Насс и Сильвен Насс в 1963 году в Стокгольмском университете с помощью электронной микроскопии и независимо учеными Эллен Харлсбруннер, Хансом Таппи и Готфридом Шацем в ходе биохимического анализа митохондриальных фракций дрожжей в Венском университете в 1964 году.

Теории возникновения митохондриальной ДНК

Согласно эндосимбиотической теории, митохондриальная ДНК происходит из кольцевых молекул ДНК бактерий и, следовательно, имеет другое происхождение, чем ядерный геном. Сейчас преобладает мнение, что митохондрии имеют монофилетическое происхождение, то есть они были приобретены предками эукариот только один раз.

Основываясь на сходстве нуклеотидных последовательностей ДНК, ближайшие родственники митохондрий среди живых прокариот считаются альфа-протеобактериями (в частности, предполагается, что риккетсии близки к митохондриям). Сравнительный анализ геномов митохондрий показывает, что в процессе эволюции происходил постепенный перенос генов предков современных митохондрий в ядро ​​клетки. Некоторые особенности митохондриальной ДНК (например, довольно большое количество интронов, нетрадиционное использование триплетов и др.) Остаются необъяснимыми с эволюционной точки зрения. Из-за ограниченного размера митохондриального генома большинство митохондриальных белков кодируется в ядре. Более того, большинство митохондриальных тРНК кодируются митохондриальным геномом.

Генетический код преподносит сюрпризы

Долгое время считалось, что у человека всего один геном — в ядре клетки. Именно его структура была расшифрована в 1953 году Фрэнсисом Криком и Джеймсом Уотсоном. Несколько лет спустя в митохондриях было обнаружено что-то вроде ДНК, небольших органелл внутри клеток. Оказывается, они содержат другой, полностью независимый геном, только гораздо меньшего размера.Информация в митохондриальной ДНК (называемой мтДНК) некоторых живых организмов кодируется по-другому ядерной молекулой, а не универсальным кодом. Различия небольшие, но фундаментальные: митохондрии обеспечивают клетку энергией. Его внутренняя мембрана производит молекулы АТФ, универсального топлива организма. Таким образом, митохондриальный геном кодирует информацию о синтезе белковых ферментов, без которого невозможно производство топлива. У человека один из самых маленьких митохондриальных геномов, всего 16,5 тысяч пар оснований, 37 генов. Для сравнения, у наземных растений сотни тысяч пар.

Они скручены вместе с белками. В свою очередь, клетки организма, в зависимости от их специализации, содержат множество митохондрий.Одно из самых удивительных открытий состоит в том, что половые клетки содержат неравное количество митохондрий. Их нет в сперме человека. Это приводит к тому, что мтДНК передается только от матери к дочери. Кроме того, он не может рекомбинировать подобно ядерной ДНК, то есть образовывать разные вариации из двух родительских хромосом. Клоны мтДНК передаются по наследству, так почему же в наших клетках два разных генома? В конце 19 века появилась гипотеза, что митохондрии — это симбиотические бактерии, живущие внутри клетки. Они были первыми на раннем этапе эволюции живого мира, которые использовали кислород для дыхания. Возможно, им было безопаснее жить внутри большой клетки, не способной к фотосинтезу. Так родился симбиоз двух типов клеток, который привел к появлению многоклеточных организмов. В настоящее время эта гипотеза стала основной

Ученые расшифровывают мтДНК

Тот факт, что у человека есть второй геном, долгое время оставался в тени, пока в конце 20 века не были разработаны новые методы секвенирования ДНК и обработки больших объемов данных. В 1987 году американские ученые сравнили митохондриальную ДНК 147 разных народов из пяти регионов Земли. Оказалось, что все они произошли от общего предка по материнской линии — митохондриальной Евы, жившей в Африке двести тысяч лет назад. Дело в том, что если определенная популяция людей разделится и каждая группа начинает вести относительно изолированный образ жизни, затем в конце накапливают несколько наборов мутаций, по количеству которых можно определить время расхождения групп. Митохондриальная ДНК оказалась очень удобной для изучения окаменелостей человека. В ядре клетки всего одна молекула ДНК, а в клетке десятки тысяч митохондрий. Кроме того, молекула мтДНК свернута в кольцо. Поэтому он более устойчив к внешним воздействиям и выдерживает даже небольшое нагревание, что важно, например, при идентификации обгоревших останков. Неандертальцы первыми расшифровали митохондриальный геном. Эту работу завершил шведский ученый Сванте Паабо в 2009 году. Теперь по относительно невысокой цене вы можете заказать тест митохондриальной ДНК в коммерческих компаниях и узнать регион происхождения предков по материнской линии.

Особенности митохондриальной ДНК

Кодирующие последовательности (кодоны) митохондриального генома имеют некоторые отличия от кодирующих последовательностей универсальной ядерной ДНК.

Таким образом, кодон AUA кодирует метионин в митохондриальном геноме (вместо изолейцина в ядерной ДНК), кодоны AGA и AGG — терминаторные кодоны (в ядерной ДНК они кодируют аргинин), кодон UGA в митохондриальном геноме кодирует триптофан.

Точнее, речь идет не о митохондриальной ДНК, а о мРНК, которая стирается (транскрибируется) с этой ДНК до начала синтеза белка. Буква U в обозначении кодона обозначает урацил, который при транскрибировании гена в РНК заменяет тимин.

Количество генов тРНК (22 гена) меньше, чем в ядерном геноме с его 32 генами тРНК .

В митохондриальном геноме человека информация настолько сконцентрирована, что в последовательностях, кодирующих мРНК, как правило, частично элиминируются нуклеотиды, соответствующие 3′-терминаторным кодонам .

Формы и число молекул митохондриальной ДНК

Электронная микроскопия показывает специфическое расположение мтДНК в митохондриях человека. Разрешение 200 нм. (A) Поперечное сечение цитоплазмы после окрашивания мтДНК частицами золота. (B) Цитоплазма после экстракции; МтДНК, связанная с частицами золота, осталась на месте. Из статьи Iborra et al., 2004. У большинства изученных организмов митохондрии содержат только кольцевые молекулы ДНК, у некоторых растений одновременно присутствуют и кольцевые, и линейные молекулы, а у ряда простейших (например, инфузорий) есть только линейные молекулы молекул.

Митохондрии млекопитающих обычно содержат от двух до десяти идентичных копий кольцевых молекул ДНК.

У растений каждая митохондрия содержит несколько молекул ДНК разного размера, способных к рекомбинации.

У протистов отряда кинетопластид (например, в трипаносомах) особый участок митохондрий (кинетопластов) содержит два типа молекул ДНК: идентичные макси-кольца (20-50 штук) длиной около 21 т.п.н и мини-кольца (20000-55000 штук, около 300 разновидностей, средняя длина около 1000 п.н.). Все кольца соединены в единую сеть (катенаны), которая разрушается и восстанавливается с каждым циклом репликации. Максимальные кольца гомологичны митохондриальной ДНК других организмов. Каждое мини-кольцо содержит четыре одинаковых консервативных участка и четыре уникальных гипервариабельных участка. Мини-кольца содержат молекулы короткой направляющей РНК, которые модифицируют РНК, транскрибируемую генами максимального кольца.

Устойчивость митохондриальной ДНК

Митохондриальная ДНК особенно чувствительна к активным формам кислорода, генерируемым дыхательной цепью из-за их близости. Хотя митохондриальная ДНК связана с белками, их защитная роль менее выражена, чем ядерная ДНК. Мутации в митохондриальной ДНК могут вызывать наследственные заболевания матери. Также есть данные, указывающие на возможный вклад мутаций митохондриальной ДНК в процесс старения и развитие возрастных заболеваний. 8 У человека митохондриальная ДНК обычно присутствует в количестве 100–10 000 копий на клетку (за исключением сперматозоидов и яйцеклеток). Множественность митохондриальных геномов связана с проявлением митохондриальных заболеваний — обычно с поздним началом и очень разнообразными симптомами.

Геном митохондрий

У млекопитающих каждая молекула мтДНК содержит 15000-17000 пар оснований (у человека 16565 пар оснований — исследование было завершено в 1981 году, согласно другому источнику, 16569 пар) и содержит 37 генов — 13 кодируют белки, 22 — гены тРНК, 2 — рРНК (один ген для 12S и 16S рРНК). Другие многоклеточные животные имеют аналогичный набор митохондриальных генов, хотя некоторые гены иногда могут отсутствовать. Генный состав мтДНК у разных видов растений, грибов и особенно простейших различается более существенно. Так, у жгутиконосца Jacobid Reclinomonas americana был обнаружен наиболее полный из известных митохондриальных геномов: он содержит 97 генов, в том числе 62 гена, кодирующих белки (27 рибосомных белков, 23 белка, участвующих в цепи переноса электронов и окислительном фосфорилировании и др.) и (См также субъединицы РНК-полимеразы).

Один из меньших митохондриальных геномов имеет малярийный плазмодий (примерно 6000 п.н., содержит два гена рРНК и три гена, кодирующих белок).

Недавно обнаруженные рудиментарные митохондрии (митосомы) некоторых протистов (дизентерийных амеб, микроспоридий и лямблий) не содержат ДНК.

Митохондриальные геномы различных видов грибов содержат от 19 431 (делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe) до 100 314 (сордариомицет Podospora anserina) пар оснований.

Некоторые растения имеют огромные молекулы митохондриальной ДНК (до 25 миллионов пар оснований), в то время как они содержат примерно те же гены и в том же количестве, что и самая маленькая мтДНК. Длина митохондриальной ДНК может широко варьироваться даже у растений одного семейства. Митохондриальная ДНК растений содержит некодирующие повторяющиеся последовательности.

Геном человека содержит только один промотор для каждой комплементарной цепи ДНК.

Митохондриальный геном человека кодирует следующие белки и РНК:

Белки или РНК	Гены
НАДН-дегидрогеназа (комплекс I)	МТ-НД1, МТ-НД2, МТ-НД3, МТ-НД4, МТ-НД4Л, МТ-НД5, МТ-НД6
Коэнзим Q — цитохром с редуктаза / цитохром b (комплекс III)	MT-CYB
цитохром с оксидаза (комплекс IV)	MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3
АТФ-синтаза	МТ-АТФ6, МТ-АТФ8
рРНК	МТ-РНР1 (12С), МТ-РНР2 (16С)
тРНК	MT-TA, MT-TC, MT-TD, MT-TE, MT-TF, MT-TG, MT-TH, MT-TI, MT-TK, MT-TL1, MT-TL2, MT-TM, MT- TN, MT-TP, MT-TQ, MT-TR, MT-TS1, MT-TS2, MT-TT, MT-TV, MT-TW, MT-TY, MT1X

Структура митохондриальной ДНК

В большинстве многоклеточных организмов мтДНК — или митогеном — организована в виде круглой, замкнутой по кругу двухцепочечной ДНК. Но у многих одноклеточных организмов (например, тетрахименов или зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii) и, в редких случаях, у многоклеточных организмов (например, у некоторых видов книдарий) мтДНК обнаруживается в виде линейно организованной ДНК. Большинство этих линейных мтДНК обладают теломеразно-независимыми теломерами (то есть концами линейной ДНК) с различными способами репликации, что сделало их интересными объектами исследования, поскольку многие из этих одноклеточных организмов с линейной мтДНК, как известно, являются патогенными.

Для митохондриальной ДНК человека (и, возможно, многоклеточных животных) в соматической клетке обычно присутствует 100–10 000 отдельных копий мтДНК (за исключением яйцеклеток и сперматозоидов). У млекопитающих каждая из кольцевых двухцепочечных молекул мтДНК состоит из 15 000-17 000 пар оснований. Две цепи мтДНК различаются по содержанию нуклеотидов, цепь, богатая гуанидом, называется тяжелой цепью (или H-цепью), а цепь, богатая цинозином, называется легкой цепью (или L цепью). Тяжелая цепь кодирует 28 генов, а легкая цепь 9 генов, всего 37 генов. Из 37 генов 13 белков-мишеней (полипептидов), 22 трансмиссии РНК-мишени (тРНК) и две малые и большие субъединицы рибосомной РНК (рРНК) нацелены. Митогеном человека содержит перекрывающиеся гены (ATP8 и ATP6, а также ND4L и ND4: см. Карту митохондриального генома человека), которые редко встречаются в геномах животных. Паттерн из 37 генов также встречается у большинства многоклеточных животных, хотя в некоторых случаях один или несколько из этих генов отсутствуют и диапазон размеров мтДНК больше. Еще большие различия в содержании и размере генов мтДНК существуют между грибами и растениями, хотя, по-видимому, существует важная подгруппа генов, присутствующих во всех эукариотах (за исключением некоторых, у которых вообще нет митохондрий). У некоторых видов растений есть огромные мтДНК (до 2 500 000 пар оснований на молекулу мтДНК), но удивительно, что даже эти огромные мтДНК содержат такое же количество и типы генов, что и растения, родственные мтДНК гораздо меньшего размера.

Геном митохондрий огурца (Cucumis Sativus) состоит из трех кольцевых хромосом (длиной 1556, 84 и 45 т.п.н.), которые полностью или в значительной степени автономны с точки зрения репликации.

Наружная мембрана

Наружная мембрана митохондрий имеет толщину около 7 нм, не образует выступов и складок, замкнута на себе. На внешнюю мембрану приходится примерно 7% площади поверхности всех мембран клеточных органелл. Основная функция — отграничить митохондрии от цитоплазмы. Наружная мембрана митохондрий состоит из липидов с вкраплениями белков (соотношение 2: 1). Особую роль играет порин, белок, образующий каналы. Он образует отверстия диаметром 2-3 нм во внешней мембране, через которые могут проникать небольшие молекулы и ионы массой до 5 кДа. Большие молекулы могут проникать через внешнюю мембрану только через активный транспорт с использованием белков транспорта митохондриальной мембраны. Наружная мембрана характеризуется наличием ферментов: монооксигеназы, ацил-КоА-синтетазы и фосфолипазы А2. Наружная мембрана митохондрий может взаимодействовать с мембраной эндоплазматической сети; играет важную роль в транспорте липидов и ионов кальция.

Межмембранное пространство

Межмембранное пространство — это пространство между внешней и внутренней мембранами митохондрий. Его размер 10-20 нм. Поскольку внешняя мембрана митохондрий проницаема для небольших молекул и ионов, их концентрация в периплазматическом пространстве мало отличается от таковой в цитоплазме. Большие белки требуют специфических сигнальных пептидов для транспорта из цитоплазмы в периплазматическое пространство; следовательно, белковые компоненты периплазматического пространства и цитоплазмы различны. Одним из белков, содержащихся не только во внутренней мембране, но и в периплазматическом пространстве, является цитохром с.

Внутренняя мембрана

Внутренняя мембрана состоит в основном из белковых комплексов (соотношение белок / липид 3: 1) и образует многочисленные гребневидные складки — гребни, которые значительно увеличивают ее поверхность и, например, в клетках печени составляет около трети всех клеток мембраны. Особенностью состава внутренней митохондриальной мембраны является наличие в ней кардиолипина — особого фосфолипида, содержащего сразу четыре жирные кислоты и делающего мембрану абсолютно непроницаемой для протонов. Еще одна особенность внутренней митохондриальной мембраны — очень высокое содержание белка (до 70% по весу), представленного транспортными белками, ферментами дыхательной цепи и большими комплексами АТФ-синтазы. Внутренняя митохондриальная мембрана, в отличие от внешней, не имеет специальных отверстий для транспорта небольших молекул и ионов; на нем со стороны, обращенной к матрице, расположены особые молекулы АТФ-синтазы, состоящие из головы, ноги и основания. Когда протоны проходят через них, синтезируется АТФ. В основе частиц, заполняющих всю толщину мембраны, лежат компоненты дыхательной цепи. Наружная и внутренняя мембраны в некоторых местах соприкасаются друг с другом, есть особый рецепторный белок, облегчающий транспорт митохондриальных белков, закодированных в ядре, в митохондриальный матрикс.

Матрикс

Матрица — это пространство, ограниченное внутренней мембраной. Матрикс (розовое вещество) митохондрий содержит ферментативные системы для окисления пирувата, жирных кислот и ферментов цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Кроме того, здесь находятся митохондриальная ДНК, РНК и аппарат синтеза белка митохондрий.

Генетическая экспертиза мтДНК

У большинства многоклеточных организмов мтДНК наследуется от матери (материнская линия). Для этого механизмы включают простое размножение (яйцеклетка содержит в среднем 200000 молекул мтДНК, в то время как здоровая человеческая сперма содержит в среднем 5 молекул), распад сперматозоидов мтДНК в мужских половых путях до оплодотворенной яйцеклетки и, По крайней мере, несколько организмов, неспособность мтДНК сперматозоидов проникнуть в яйцеклетку. Каким бы ни был механизм, это униполярное наследование, наследование мтДНК, которое встречается у большинства животных, растений и грибов.

Наследование по материнской линии

При половом размножении митохондрии обычно наследуются исключительно от матери; митохондрии в сперме млекопитающих обычно разрушаются яйцеклеткой после оплодотворения. Кроме того, большая часть митохондрий находится в основании хвоста сперматозоидов, который используется для перемещения сперматозоидов; иногда при оплодотворении теряется хвост. В 1999 году сообщалось, что митохондрии отцовского сперматозоида (содержащие мтДНК) были помечены убиквитином для разрушения внутри эмбриона. Некоторые методы ЭКО, особенно введение спермы в яйцеклетку, могут этому помешать.

Тот факт, что митохондриальная ДНК передается по наследству от матери, позволяет генеалогическим исследователям проследить материнскую линию в прошлом. (Y-хромосомная ДНК наследуется по отцовской линии, используется аналогичным образом для определения отцовской истории.) Обычно это делается на митохондриальной ДНК человека путем секвенирования гипервариабельной контрольной области (HVR1 или HVR2), а иногда и всей молекулы митохондриальной ДНК в качестве генеалогического теста история ДНК. Например, HVR1 составляет около 440 б.п. Эти 440 пар затем сравниваются с контрольными участками других индивидуумов (или конкретных индивидуумов или субъектов в базе данных) для определения материнской линии. Наиболее частое сравнение — с пересмотренной Кембриджской эталонной последовательностью. Вила и др. опубликовали исследование материнского сходства между домашними собаками и волками. Концепция митохондриальной Евы основана на том же типе анализа, пытаясь обнаружить происхождение человечества, прослеживая происхождение во времени.

мтДНК высоко консервативна, и ее относительно низкая скорость мутаций (по сравнению с другими участками ДНК, такими как микросателлиты) делает ее полезной для изучения эволюционных взаимоотношений — филогении организмов. Биологи могут идентифицировать, а затем сравнивать последовательности мтДНК у разных видов и использовать сравнения для построения эволюционного древа для изучаемых видов. Однако из-за медленных темпов мутаций, которые он испытывает, часто бывает трудно различить близкородственные виды в какой-либо степени, поэтому необходимо использовать другие методы анализа.

Мутации митохондриальной ДНК

Можно ожидать, что люди с односторонним наследованием и незначительной рекомбинацией или без нее будут подвергаться трещотке Мюллера, накоплению вредных мутаций, ведущих к потере функции. Популяции животных в митохондриях избегают этого накопления из-за процесса развития, известного как «узкое место» мтДНК. Узкое место использует стохастические процессы в клетке для увеличения межклеточной изменчивости мутантной нагрузки по мере развития организма, так что яйцо с определенным количеством мутантной мтДНК создает эмбрион, в котором разные клетки имеют разные мутанты. Затем клеточный слой может быть выбран для удаления этих клеток с множеством мутантных мтДНК, что приводит к стабилизации или снижению мутантной нагрузки между поколениями. Механизм, стоящий за узким местом, обсуждается с недавними математическими и экспериментальными метастазами и предоставляет доказательства комбинации случайного расщепления мтДНК на клеточные деления и случайного оборота молекул мтДНК внутри клетки.

Наследование по отцовской линии

У двустворчатых моллюсков наблюдается двойное однонаправленное наследование мтДНК. У этих видов самки имеют только один тип мтДНК (F), тогда как самцы имеют мтДНК типа F в своих соматических клетках, но мтДНК типа M (которая может расходиться до 30%) в половых клетках. В митохондриях, унаследованных от матери, также сообщалось о некоторых насекомых, таких как дрозофилы, пчелы и периодические цикады.

Наследование митохондрий по самцам было недавно обнаружено у кур Плимут-Рок. Доказательства подтверждают редкие случаи наследования митохондрий мужского пола у некоторых млекопитающих. Примечательно, что существуют задокументированные случаи у мышей, когда наследственные митохондрии мужского пола впоследствии были отторгнуты. Кроме того, он был обнаружен у клонированных овец и крупного рогатого скота. Однажды его нашли в теле мужчины.

В то время как многие из этих случаев связаны с клонированием эмбриона или последующим отторжением отцовских митохондрий, другие документируют наследование in vivo и сохранение в лабораторных условиях.

Транскрипция митохондриальной ДНК

В митохондриях животных каждая цепь ДНК непрерывно транскрибируется и производит полицистронную молекулу РНК. TRNA присутствуют в большинстве (но не во всех) регионах, кодирующих белок (см. Карту генома митохондрий человека). Во время транскрипции тРНК принимает характерную L-форму, которая распознается и расщепляется специфическими ферментами. При процессинге митохондриальной РНК отдельные фрагменты мРНК, рРНК и тРНК высвобождаются из первичного транскрипта. Следовательно, свернутые тРНК действуют как второстепенная пунктуация.

Применение

Изучение митохондриального генома не только используется при построении различных филогенетических теорий, но и является основным инструментом идентификации. Возможность идентификации связана с групповыми и даже индивидуальными различиями, существующими в митохондриальном геноме человека.

Последовательность участка гена субъединицы I цитохром-с-оксидазы, кодируемого в митохондриальной ДНК, широко используется в проектах штрихового кодирования ДНК животных, определяющих, принадлежит ли организм к определенному таксону, на основе коротких маркеров в его ДНК. Для штрих-кодирования растений в основном используется комбинация двух маркеров в пластидной ДНК .

Группа Шухрата Миталипова в Центре эмбриональных клеток и генной терапии Университета Орегона разработала метод замены митохондриальной ДНК для лечения наследственных митохондриальных заболеваний. Сейчас в Великобритании начались клинические испытания этого метода, получившего неофициальное название «методика с тремя родителями» — «ребенок с тремя родителями». Также известно, что в Мексике после этой процедуры родился ребенок .

Немного фактов

• Согласно эндосимбиотической теории, мтДНК происходит из кольцевых молекул ДНК бактерий и, следовательно, имеет другое происхождение, чем ядерный геном. Сейчас преобладает мнение, что митохондрии имеют монофилетическое происхождение, то есть они были приобретены предками эукариот только один раз.
• МтДНК — единственная кольцевая хромосома у человека. И это ключ к происхождению всех клеток животных, растений и грибов: эукариот.
• Сравнительный анализ геномов митохондрий показывает, что в процессе эволюции происходил постепенный перенос генов предков современных митохондрий в ядро ​​клетки. Некоторые характеристики мтДНК остаются необъясненными с эволюционной точки зрения (например, довольно большое количество интронов, нетрадиционное использование триплетов и др.). Из-за ограниченного размера митохондриального генома большинство митохондриальных белков кодируется в ядре. Более того, большинство митохондриальных тРНК кодируются митохондриальным геномом.
• мтДНК особенно чувствительна к реактивным формам кислорода, генерируемым дыхательной цепью, из-за их непосредственной близости.